三种方法测定地面游离蚤的效果观察

目的比较水盘法、粘蚤纸法及粘蝇板法等三种方法现场测定地面游离蚤的效果。方法选择云南省景洪市景讷乡4个村54户家庭作为研究对象,其中2个村同时布放水盘及粘蚤纸,另外2个村同时放置水盘及粘蝇板测定地面游离蚤,分别计算不同方法对地面游离蚤的捕获率,并进行结果比较。结果同时布放粘蚤纸及水盘的勐混和小寨,粘蚤纸法和水盘法的捕获率分别为44.50%(283/636)和80.85%(494/611),两种方法对地面游离蚤的捕获率差异有统计学意义(χ2=175.33,P0.01);同时布放粘蝇板及水盘的大寨和新寨,粘蝇板法及水盘法捕获率分别为54.06%(353/653)和69.78%(448/642),捕获率测定结果差异有统计学意义(χ2=33.09,P0.01)。不同村寨水盘法的捕获率80.85%(494/611)和69.78%(449/642),与粘蚤纸法和粘蝇板法的捕获率44.50%(283/636)和54.06%(353/653)交叉比较,差异有统计学意义(χ2=83.40,P0.01和χ2=102.48,P0.01)。分别布放在不同村寨的粘蚤纸及粘蝇板对地面游离蚤的捕获率44.50%(283/636)和54.06%(353/653),差异有统计学意义(χ2=11.78,P0.01)。结论水盘法对地面游离蚤的收集效果明显优于粘蚤纸法及粘蝇板法,粘蝇板法虽然捕获率优于粘蚤纸法,但实际应用中存在缺点。水盘法更适合在基层鼠疫监测工作中使用。     

云南省水富市小兽及其体表蚤类的组成与分布

目的 了解水富市小兽与其体表蚤类的群落结构和分布特征,为鼠传疾病的监测和防控提供参考。方法 2019年5月在水富市4个乡镇海拔在300~1 500 m的居民区、农耕地和林地3种生态环境,选取8个样区,用笼夜法和5 m夹线法捕获小兽,梳捡其体表寄生蚤,对小兽和蚤分类鉴定,并计算群落生态学指标。结果 共捕获小兽140只,隶属于2 目3 科 8 属11 种,优势种为针毛鼠（35.00%）、北社鼠（10.71%）和中国鼩猬（10.00%）。居民区、农耕区和林区的捕获率分别为1.56% 、6.03%和15.21%,差异有统计学意义（χ²=103.64,P<0.001）,在3种生态环境中,居民区的小兽物种丰富度、多样性指数相对较小,而生态优势度高于其他两种生境,农耕区和林区小兽物种丰富度、多样性、均匀度,优势度均无明显区别。小兽物种丰富度在1 000~1 500 m海拔带最高为8种,3个海拔梯度物种多样性指数在1.588~1.839,均匀度指数在0.764~0.945,生态优势度在0.172~0.271,3个海拔带小兽捕获率分别为4.36% 、4.43%和9.69%,差异有统计学意义（χ²=23.98,P<0.001）。共检获寄生蚤41匹,隶属于4科5属7种,优势种为缓慢细蚤（36.59%）和近端远棒蚤二刺亚种（30.77 %）,平均染蚤率为15.71%,总蚤指数为0.29。林区的寄生蚤物种丰富度最高为4种,居民区蚤指数最高为1.357。在不同生境和不同海拔带中,寄生蚤生态优势度均较低,在0.396~0.769之间。结论 水富市小兽与其寄生蚤生物多样性不高,鼠密度和蚤指数相对低,可能与当地生态环境比较单一有关。进一步开展小兽及其体表蚤类等媒介监测对相关自然疫源性疾病的防控具有重要意义。     

鼠疫菌caf1基因特异性片段的克隆表达及其抗原与抗体反应

目的 克隆表达鼠疫菌caf1基因上的特异性片段并检测.方法 分别选取F1上C端(caf1-C)及N端(caf1-N)两段B细胞表位进行克隆表达;PCR扩增目的基因,并与表达质粒pET32a(+)进行连接,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)并诱导表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并以Western-blot法检测其抗原与抗体反应.结果 分别诱导表达出大小为26000的Caf1-C和25000的Caf1-N两个片段,2个重组蛋白均以可溶形式存在,并与鼠疫免疫血清有良好的反应.结论 克隆表达出具有抗原与抗体反应的鼠疫菌F1抗原上的两段B细胞表位,为鉴定是否是F1位点交叉奠定了基础.     

应用PCR方法检测鼠疫现场标本的研究

目的用PCR方法检测疑似鼠疫现场标本,以建立准确、简便和快速的诊断技术。方法对采自疫源地的自毙鼠标本用两种方法提取DNA,进行caf1、pla基因检测和染色体标识基因检测。结果 2份样本均能检测到caf1、pla基因(与Yersinia pestis caf1、pla基因序列比对同源性达到99%以上)和4个染色体标识基因ypo 2087、ypo 2090、ypo2094、ypo 2102,试剂盒提取方式敏感性高于煮沸法。结论优化模板提取方式、提高扩增效率、质粒和染色体多基因检测,可以提高鼠疫PCR诊断技术的检出率。     

云南省家、野鼠两型鼠疫菌比较蛋白质组的初步研究

云南省存在家、野鼠两型鼠疫疫源地.已有研究证实,两型鼠疫菌具有不同的生物学特性[1],对人群的危险度也不尽相同.进一步探究二者间的差异,为制定合理的防治策略提供更多依据.蛋白质组分析是一种以双向电泳和飞行质谱鉴定为核心技术的方法,具有高通量、重复性好以及较敏感等优点.在鼠疫菌的蛋白质组分析中,有针对鼠疫菌Ⅲ型分泌系统低钙反应抗原[2,3]、鼠疫菌毒力相关蛋白[4,5]、外膜蛋白和内膜蛋白[6,7],以及针对不同生长条件下蛋白质组差异表达的分析[8].本研究旨在通过对云南家、野鼠两型鼠疫菌的比较蛋白质组分析,寻找二者之间的差异蛋白及探讨其意义.     

野生型鼠疫噬菌体YP060的分离和生物学特性鉴定

目的 从鼠疫疫源地鼠巢中分离1株野生型鼠疫噬菌体(YP060)并分析其生物学特性。方法 采用双层琼脂平皿法从云南省鼠疫疫源地鼠巢中分离鼠疫噬菌体;描述其形态特征;了解裂解能力、宿主谱、最佳感染复数、一步生长特性;分析不同温度和pH值、紫外线、氯仿对噬菌体的敏感性。结果 YP060形态呈蝌蚪形,头部为正多面体结构,带有一伸缩的尾鞘;对鼠疫疫苗株EV76的最佳感染复数为0.1;潜伏期为50 min,暴发期为80 min;宿主谱评价显示,YP060仅裂解鼠疫疫苗株;YP060在30~50℃具有较强的热稳定性;pH值5~10范围内均有较强的裂解活性;对紫外线比较敏感;对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。结论 本研究为国内首次从鼠疫疫源地鼠巢中分离到鼠疫噬菌体YP060,该噬菌体具有窄宿主谱和较强的生物学裂解特性。     

从表达菌培养液中提取鼠疫菌重组F1抗原

目的从表达鼠疫耶尔森氏菌F1蛋白的诱导培养液中提取纯化重组F1并检测其免疫反应性。方法收集诱导培养后离心去除菌体的培养液,采用硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法提取F1蛋白,产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)鉴定其免疫反应性。结果硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法均能从培养液中提取到重组F1蛋白,产物经纯化后可与鼠疫疫苗株免疫兔血清和既往鼠疫患者血清发生特异性结合反应。结论该表达菌表达效能较高,在诱导培养液中存在大量具有免疫学活性的重组F1蛋白。     

云南省2018年动物间鼠疫监测调查与分析

目的 掌握和分析云南省2018年鼠疫疫情现况,为鼠疫防控对策提供科学依据。方法 2018年对云南省104个县(市)开展鼠疫宿主、媒介、病原学和血清学监测,并对监测结果统计学分析。结果 黄胸鼠疫源地以黄胸鼠、褐家鼠为优势种;齐氏姬鼠-大绒鼠疫源地以齐氏姬鼠、大绒鼠为优势种,黄胸鼠疫源地黄胸鼠鼠体蚤以印鼠客蚤和缓慢细蚤为主;褐家鼠以缓慢细蚤、人蚤和印鼠客蚤为主。齐氏姬鼠-大绒鼠疫源地齐氏姬鼠鼠体蚤以棕形额蚤、特新蚤指名亚种为主;大绒鼠鼠体蚤以方叶栉眼蚤为主,特新蚤指名亚种为次要寄生染蚤种。对47 618只动物进行细菌学检验,检出鼠疫菌4株;对20 710组媒介进行细菌学检验,结果均为阴性。应用鼠疫间接血凝试验方法检验动物血清20 105份,阳性4份,应用鼠疫反相间接血凝试验方法检验动物脏器23份,阳性5份。结论 云南省野鼠疫源地玉龙县和古城区发生动物鼠疫流行,流行强度猛烈,家鼠疫源地未发生鼠疫疫情,但是形势不容乐观,应加强对全省鼠疫的监测和健康教育工作。     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

云南鼠疫菌AscI酶切分型及其流行病学意义

目的构建以AscI酶切的云南省鼠疫菌PFGE图谱库并探究其流行病学意义。方法采用限制性内切酶AscI对云南家、野鼠型及玉龙鼠疫菌进行酶切分析,并对电泳图谱进行聚类分析。结果30株被试菌株分为15种PFGE型别（相似性系数为88．9％～100．0％）、5个簇、4个群,除404号菌与EV76归为一群,其余3个群分别为家鼠型基因群、野鼠型基因群及玉龙基因群。结论云南鼠疫菌PFGE基因型与生态型相吻合,具有一定的区域聚集性;玉龙鼠疫菌是云南独立的一个基因群。